በጎልደን ጌት እና በጊብሰን ጉባኤ መካከል ያለው ቁልፍ ልዩነት ወርቃማው በር የሚወሰነው በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ እገዳዎች መኖራቸውን ነው ፣ የጊብሰን ጉባኤ ግን በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ የእገዳ ጣቢያዎች መኖራቸውን አይመካም ተዘግቷል።
ባለፉት አስርት ዓመታት ውስጥ የሞለኪውላር ሳይንቲስቶች በርካታ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ወደ አንድ ቁራጭ በቀላሉ ለመገጣጠም የሚያስችሉ የተለያዩ ደረጃቸውን የጠበቁ ሂደቶችን ፈጥረዋል። ስለዚህ እንደ Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly እና TOPO Cloning የመሳሰሉ የክሎኒንግ ዘዴዎች በተመራማሪዎች በሳይንሳዊ ሙከራዎች በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ።ስለዚህ ጎልደን ጌት እና ጊብሰን መሰብሰቢያ ሁለት ሞለኪውላር ክሎኒንግ ዘዴዎች ሲሆኑ በርካታ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ወደ አንድ ቁራጭ እንዲገጣጠሙ ያስችላቸዋል።
የጎልደን በር መሰብሰቢያ ምንድነው?
ወርቃማው በር ብዙ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ወደ አንድ ቁራጭ ለመገጣጠም የሚያግዝ ሞለኪውላዊ ክሎኒንግ ዘዴ ነው። ይህ ዘዴ ክሎኒንግ ለማድረግ በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ የተከለከሉ ቦታዎች መኖራቸውን ይወሰናል. የመነጨው በ1996 ነው። ይህ ዘዴ የአይአይኤስ ገደብ ኢንዛይሞችን እና T4 DNA ligase ይጠቀማል። እነዚህ ኢንዛይሞች ዲ ኤን ኤውን ከማወቂያ ቦታዎች ውጭ ይቆርጣሉ። ፓሊንድሮሚክ ያልሆኑ ከመጠን በላይ መሸፈኛዎችን መፍጠር ይችላሉ. ስለዚህ፣ በርካታ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ከመጠን በላይ የተንጠለጠሉ ቅደም ተከተሎችን በመጠቀም ሊገጣጠሙ ይችላሉ።
ሥዕል 01፡ ወርቃማው በር
የወርቃማው በር መሰብሰቢያ ሂደት
የወርቃማው በር ቴክኒክ በአሰራሩ ውስጥ ዋና ሶስት እርከኖች አሉት፡
- በክሎኒንግ ቬክተር ውስጥ ከመጠን በላይ መጨናነቅ መፍጠር፣
- የበርካታ የዲኤንኤ መጨመሪያዎች ስብስብ ቁርጥራጭ-ተኮር ቅደም ተከተሎችን ከመጠን በላይ በመያዣዎች በመጠቀም እና
- ligation።
የወርቃማው በር ስብሰባ ክብ ክሎኒንግ ቬክተር (መዳረሻ ቬክተር) ይጠቀማል። ከዚህም በላይ በዚህ ዘዴ ውስጥ, እገዳው ቦታ በአንድ ጊዜ መፈጨትን እና መቆራረጥን ለማካሄድ ከተሰካው ምርት ውስጥ ይወገዳል. ለጎልደን ጌት የተለመደው የሙቀት ዑደት ፕሮቶኮል በ37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና በ16 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ይወዛወዛል ምክንያቱም 37 ° ሴ ለገደብ ኢንዛይሞች ተስማሚ ነው እና 16 ° ሴ ለሊጋሶች ጥሩ ነው።
የጊብሰን ጉባኤ ምንድነው?
ጊብሰን መሰብሰቢያ ብዙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ወደ አንድ ቁራጭ እንዲገጣጠሙ የሚያስችል ሞለኪውላዊ ክሎኒንግ ዘዴ ነው። ከወርቃማው በር ዘዴ በተለየ ይህ ዘዴ ክሎኒንግ ለማድረግ በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ የእገዳ ቦታዎች መኖራቸውን አይመካም.የተገኘው በጄ ክሬግ ቬንተር ተቋም ባልደረባ ዳንኤል ጂ ጊብሰን ነው። ይህ ቴክኒክ ተከታታይ እና ligase ገለልተኛ ክሎኒንግ (SLIC) ዘዴ አይነት ነው።
ምስል 02፡ ጊብሰን ጉባኤ
የጊብሰን መሰብሰቢያ ሂደት
የጊብሰን መሰብሰቢያ ከ20-40 የመሠረት ጥንዶች ከተጠጋጋ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ጋር የተደራረቡ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ያስፈልገዋል። መደራረቦች በ PCR በኩል ይታከላሉ. ከዚያም እነዚህ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ሶስት ኢንዛይሞች ባለው የጊብሰን ማዘር ድብልቅ ውስጥ ይጨምራሉ. ይህ ሂደት የሚከናወነው በ isothermal ሁኔታዎች (50 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ 1 ሰዓት) በሶስት የተለያዩ ኢንዛይሞች ማለትም exonuclease, DNA polymerase እና DNA ligase በመጠቀም ነው. ኤክሰኑክሊዝ ዲኤንኤን ከ5' ጫፍ ይመልሳል። ስለዚህ, የ polymerase እንቅስቃሴን አይገታም እና ምላሹን በአንድ ነጠላ ሂደት ውስጥ እንዲቀጥል አይፈቅድም.በአጎራባች የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ላይ የተገኙት ነጠላ-ክንድ ክልሎች በተደራረቡ ቅደም ተከተሎች ምክንያት ሊሰረዙ ይችላሉ። ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ኑክሊዮታይድ በመጨመር ክፍተቶቹን ይሞላል. በመጨረሻም፣ የዲኤንኤ ሊጋዝ ከጎን ያሉት ክፍሎች ዲኤንኤን ይቀላቀላል። በተለምዶ ጊብሰን መሰብሰቢያ መስመራዊ የመድረሻ ቬክተሮችን ይጠቀማል። በተጨማሪም ይህ ዘዴ በቅደም ተከተል ተመሳሳይነት ላይ በመመስረት እስከ 15 የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን በአንድ ጊዜ ማጣመር ይችላል።
በጎልደን በር እና በጊብሰን ጉባኤ መካከል ያሉ ተመሳሳይነቶች
- Golden Gate እና Gibson Assembly ሁለት ሞለኪውላር ክሎኒንግ ዘዴዎች ናቸው።
- ሁለቱም ዘዴዎች በርካታ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ወደ አንድ ቁራጭ ማሰባሰብ ይችላሉ።
- እነዚህ ዘዴዎች የመድረሻ ቬክተሮችን ይጠቀማሉ።
- ሁለቱም ዘዴዎች ብዙ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ለማገናኘት የሙቀት ሳይክሎችን ይጠቀማሉ።
- በሳይት ዳይሬክት ሙታጄኔሲስ ጥቅም ላይ ይውላሉ።
በጎልደን በር እና በጊብሰን ጉባኤ መካከል ያለው ልዩነት
ወርቃማው በር ብዙ የዲ ኤን ኤ ፍርስራሾችን ወደ አንድ ቁራጭ ለመገጣጠም የሚያገለግል ሞለኪውላዊ ክሎኒንግ ዘዴ ነው ፣ ይህም በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ የሚከለከሉ ቦታዎች መኖራቸውን በመመርኮዝ ነው ፣ ጊብሰን ስብሰባ ደግሞ በ ብዙ የዲ ኤን ኤ ፍርስራሾችን ወደ አንድ ቁራጭ መሰብሰብ በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ እገዳዎች መኖራቸውን ሳይመኩ.ይህ በወርቃማው በር እና በጊብሰን ስብሰባ መካከል ያለው ቁልፍ ልዩነት ነው። በተጨማሪም የጎልደን ጌት ዘዴ ክብ መድረሻ ቬክተር ይጠቀማል፣ የጊብሰን መሰብሰቢያ ዘዴ ደግሞ መስመራዊ መድረሻዎች ቬክተር ይጠቀማል።
የሚከተለው ኢንፎግራፊክ በጎልደን ጌት እና በጊብሰን ጉባኤ መካከል ያለውን ልዩነት ያሳያል።
ማጠቃለያ - ጎልደን ጌት vs ጊብሰን ጉባኤ
ሞለኪውላር ክሎኒንግ ድጋሚ የዲ ኤን ኤ ሞለኪውሎችን ለመገጣጠም እና በተቀባይ ፍጥረታት ውስጥ መባዛታቸውን ለመምራት የሚያገለግል ዘዴ ነው። ወርቃማው በር እና ጊብሰን መሰብሰቢያ ሁለት ሞለኪውላዊ ክሎኒንግ ዘዴዎች ሲሆኑ በርካታ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ወደ አንድ ቁራጭ እንዲሰበሰቡ ያስችላቸዋል። ወርቃማው በር ዘዴ የሚከለከለው በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ ባሉ እገዳዎች መገኘት ላይ ነው ፣ የጊብሰን ስብሰባ ግን በተወሰነ ቅደም ተከተል ውስጥ እገዳዎች መኖራቸውን አይመካም። ስለዚህ፣ በጎልደን በር እና በጊብሰን ጉባኤ መካከል ያለው ቁልፍ ልዩነት ይህ ነው።
