የቁልፍ ልዩነት - ማክም ጊልበርት vs Sanger ቅደም ተከተል
Nucleotides የዲኤንኤ መሰረታዊ መዋቅራዊ አሃዶች እና ህንጻዎች ናቸው። የዲኤንኤ ሞለኪውል ከፖሊኑክሊዮታይድ ሰንሰለት የተዋቀረ ነው። በዲ ኤን ኤ ውስጥ አራት የተለያዩ ኑክሊዮታይዶች አሉ። እነዚህ ኑክሊዮታይዶች A (አዲኒን)፣ ጂ (ጉዋኒን)፣ ሲ (ሳይቶሲን)፣ ቲ (ቲሚን) የተሰየሙ አራት የተለያዩ ናይትሮጅን መሠረቶችን ያቀፉ ናቸው። በዲ ኤን ኤ ሞለኪውል ውስጥ ያለው የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ለሰውነት እድገትና እድገት ጠቃሚ የሆነ የዘረመል መረጃን ስለሚያስቀምጥ ትልቅ ጠቀሜታ አለው። የዲኤንኤ ቅደም ተከተል የዲኤንኤውን ትክክለኛ የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል የሚወስን ሂደትን ያመለክታል። የተለያዩ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴዎች አሉ.ማክም ጊልበርት ቅደም ተከተል እና የሳንገር ዲኤንኤ ቅደም ተከተል የአንደኛ ትውልድ ቅደም ተከተል የሆኑ ሁለት የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴዎች ናቸው። የማክም ጊልበርት ቅደም ተከተል ቅደም ተከተል የሚወሰነው በእያንዳንዱ አራት ኑክሊዮታይድ እና ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝ ላይ የ 5' ጫፍ ላይ ምልክት የተደረገባቸውን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች በኬሚካላዊ መንገድ በመቁረጥ ነው። የሳንገር ቅደም ተከተል ሂደት ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬሴ እና ዲኦክሲንክሊዮታይድ እና ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ በመጠቀም ነጠላ-ክር ያለው ዲ ኤን ኤ በማቀናጀት የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ይወስናል። ይህ በማክም ጊልበርት እና በሳንገር ቅደም ተከተል መካከል ያለው ቁልፍ ልዩነት ነው።
Maxam Gilbert Sequencing ምንድን ነው?
ማክም ጊልበርት ተከታታይነት፣ እንዲሁም ኬሚካላዊ ቅደም ተከተል ዘዴ ተብሎ የሚታወቀው፣ በዲ ኤን ኤ ውስጥ የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ለመወሰን የተሰራ ቴክኒክ ነው። ይህ ዘዴ በ1976 ዋልተር ጊልበርት እና አላን ማክስም አስተዋውቀዋል እና በቀጥታ በተጣራ ዲ ኤን ኤ ሊከናወን ስለሚችል ተወዳጅ ሆነ። የማክም ጊልበርት ዘዴ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል የመጀመሪያው ትውልድ ነው, እና በሳይንቲስቶች በስፋት ጥቅም ላይ የዋለው የመጀመሪያው ቅደም ተከተል ዘዴ ነበር.
የዚህ ዘዴ መሰረታዊ መርሆ በሥዕሉ 01 ላይ እንደሚታየው በመጨረሻ ምልክት የተደረገባቸው የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን በተወሰኑ መሠረቶች ላይ በመሠረታዊ ልዩ ኬሚካሎች እና ሁኔታዎች በመገደብ እና የተሰየሙትን ቁርጥራጮች በኤሌክትሮፊዮሬሲስ በመለየት በስእል 01 ላይ ነው። በጄል ላይ ወደ መጠኖቻቸው. ቁርጥራጮቹ የተሰየሙ በመሆናቸው የዲኤንኤ ሞለኪውል ቅደም ተከተል በቀላሉ ሊታወቅ ይችላል።
Maxam ጊልበርት ዘዴ ዲኤንኤን በተወሰኑ መሠረቶች ለመስበር ቤዝ የተወሰኑ ኬሚካሎችን ይጠቀማል። ዲሜቲል ሰልፌት እና ሃይድራዚን የተባሉ ሁለት የተለመዱ ኬሚካሎች ፑሪን እና ፒሪሚዲንን በቅደም ተከተል ለማጥቃት ያገለግላሉ።
ማክም ጊልበርት ተከታታይነት ያለው ዘዴ በበርካታ ደረጃዎች ይከናወናል።
- የእገዳን ኢንዶኑክሊየስ በመጠቀም የዲኤንኤውን ቅደም ተከተል ማጥራት
- የሬዲዮአክቲቭ ፎስፌትስን በመጨመር የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ጫፍ መሰየም
- የተለጠፉትን ፍርስራሾች ከማይሰየሙ ፍርስራሾች በጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ
- በመጨረሻ የተለጠፈውን ዲ ኤን ኤ በአራት ቱቦዎች መለየት እና በመሠረታዊ ልዩ ኬሚካሎች መታከም
- የእያንዳንዱ ቱቦ ይዘት ኤሌክትሮፊዮራይዝስ በተለየ መስመሮች ላይ በጄል እና በቁርጭምጭሚት መለያየት ላይ እንደ ርዝመታቸው።
- ቁርጥራጮቹን በአውቶራዲዮግራፍ ማግኘት።
ሥዕል 01፡ ማክም ጊልበርት ተከታታይነት
Sanger ቅደም ተከተል ምንድን ነው?
Sanger Sequencing በፍሬድሪክ ሳንገር እና ባልደረቦቹ እ.ኤ.አ. የሰንሰለት ማብቂያ ቅደም ተከተል ወይም Dideoxy sequencing ዘዴ በመባልም ይታወቃል። ይህ ዘዴ የሚሠራው ነጠላ ፈትል ዲ ኤን ኤ ሲዋሃድ እንደ ddGTP፣ ddCTP፣ ddATP እና ddTTP በዲኤንኤ ፖሊመሬሴ ያሉ ሰንሰለቶችን የሚቋረጡ ዲኦክሲኑክሊዮታይድ (ddNTPs) የተመረጠ ውህደት መርህ ላይ ነው።Dideoxynucleotides ከጎን ኑክሊዮታይድ ጋር የፎስፎዲስተር ቦንዶችን ለመፍጠር 3' OH ቡድኖች ይጎድላቸዋል። ስለዚህ፣ የሳንጀር ቅደም ተከተል በነበረበት ወቅት ddNTP አዲስ በሚፈጠር ፈትል ውስጥ ከተካተተ የክር ምስረታው ይቆማል።
በዚህ ዘዴ አራት የተለያዩ የዲኤንኤ ሲንተሲስ ግብረመልሶች (PCR) በአራት የተለያዩ ቱቦዎች አንድ ዓይነት ዲኤንቲፒ ይከናወናሉ። ለ PCR ቱቦዎች ሌሎች መስፈርቶች እንዲሁ ፕሪመርስ ፣ ዲኤንቲፒ ፣ ታክ ፖሊሜሬሴ ፣ የተወሰኑ ሁኔታዎች ፣ ወዘተ ጨምሮ ቀርበዋል ። አራት የተለያዩ ምላሾች በአራት ድብልቅ በአራት ቱቦዎች ይከናወናሉ ። ከ PCR ምላሽ በኋላ የዲኤንኤ ቁርጥራጮች በጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ የተከፋፈሉ እና የተከፋፈሉ ናቸው። ከዚያም ቁርጥራጮቹ በምስል 02 ላይ እንደሚታየው (ራዲዮአክቲቭ ወይም ፍሎረሰንት) ፕሪመር ወይም ዲኤንቲፒ በመጠቀም ይታያሉ።
ሥዕል 02፡ Sanger ቅደም ተከተል
በMaxam Gilbert እና Sanger Sequencing መካከል ያለው ልዩነት ምንድን ነው?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| ማክም ጊልበርት ቅደም ተከተል ለዲኤንኤ ቅደም ተከተል የተሰራ የመጀመሪያው ቴክኒክ ነው። | የሳንገር ቅደም ተከተል ዘዴ የመጣው ከማክም ጊልበርት ቅደም ተከተል ዘዴ በኋላ ነው። |
| አጠቃቀም | |
| ይህ ዘዴ ብዙም ጥቅም ላይ አይውልም። | Sanger ቅደም ተከተል በመደበኛነት ለመከታታል ጥቅም ላይ ይውላል። |
| የአደገኛ ኬሚካሎች አጠቃቀም | |
| አደገኛ ኬሚካሎችን ይጠቀማል። | የአደገኛ ኬሚካሎች አጠቃቀም ከማክም ጊልበርት ዘዴ ጋር ሲነጻጸር የተገደበ ነው። |
| ለመለየት መለያ መስጠት | |
| ይህ ዘዴ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ጫፍ ለመሰየም ራዲዮአክቲቭ P32 ይጠቀማል። | Sanger ቅደም ተከተል በሬዲዮአክቲቭ ወይም በፍሎረሰንት የተለጠፉ ddNTPs ይጠቀማል። |
ማጠቃለያ – ማክም ጊልበርት vs Sanger ቅደም ተከተል
Maxam Gilbert እና Sanger sequencing በመጀመርያው ትውልድ ዲኤንኤ ቅደም ተከተል የሚመጡ ሁለት አይነት የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ቴክኒኮች ናቸው። ማክም ጊልበርት ቅደም ተከተል በ 1976 ለመጀመሪያ ጊዜ ለዲኤንኤ ቅደም ተከተል አስተዋወቀ እና የሚከናወነው በመጨረሻው ምልክት የተደረገባቸውን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች በመሠረታዊ ልዩ ኬሚካሎች በመስበር ነው። ስለዚህም ኬሚካላዊ ቅደም ተከተል በመባል ይታወቃል. የሳንገር ቅደም ተከተል ዘዴ በ1977 ተጀመረ፣ እና በዲዲኤንቲፒ ተነዱ የሰንሰለት ማብቂያ ምላሾች ላይ የተመሰረተ ነው። ከማክም ጊልበርት ዘዴ ታዋቂ የሆነው የሳንገር ቅደም ተከተል የማክም ጊልበርት ዘዴ ብዙ ጉዳቶች በመሳሰሉት እንደ ከመጠን ያለፈ የጊዜ አጠቃቀም፣ አደገኛ ኬሚካሎች አጠቃቀም፣ ወዘተ.ይህ በማክም ጊልበርት እና በሳንገር ቅደም ተከተል መካከል ያለው ልዩነት ነው።
