የቁልፍ ልዩነት - የሳንገር ቅደም ተከተል ከ ፒሮሴክዌንሲንግ
የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ለዲኤንኤ ትንተና በጣም አስፈላጊ ነው ምክንያቱም በአንድ የተወሰነ የዲኤንኤ ክልል ላይ ትክክለኛ የኑክሊዮታይድ አደረጃጀት እውቀት ስለ እሱ ብዙ ጠቃሚ መረጃዎችን ያሳያል። የተለያዩ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴዎች አሉ. Sanger sequencing እና Pyrosequencing በ ሞለኪውላር ባዮሎጂ ውስጥ በስፋት ጥቅም ላይ የዋሉ ሁለት የተለያዩ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴዎች ናቸው። በሳንገር ቅደም ተከተል እና በፒሮሴኬንሲንግ መካከል ያለው ቁልፍ ልዩነት Sanger sequencing የዲኤንኤ ውህደትን ለማቋረጥ ዲኦክሲንክሊዮታይድ በመጠቀም የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተሎችን ለማንበብ pyrosequencing ደግሞ ኑክሊዮታይድን በማካተት የፒሮፎስፌት ልቀትን በመለየት እና የተጨማሪ ቅደም ተከተሎችን በማቀናጀት የትዕዛዙን ትክክለኛ ቅደም ተከተል ያንብቡ።
Sanger ቅደም ተከተል ምንድን ነው?
የሳንገር ቅደም ተከተል በ1977 በፍሬድሪክ ሳንግገር እና በኮሌጆቹ የተሰራ የመጀመርያው ትውልድ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴ ነው።ይህም ሰንሰለት ማቋረጥ ሴኬንሲንግ ወይም Dideoxy sequencing በመባልም ይታወቃል። ይህ ዘዴ አዲሱ ትውልድ ቅደም ተከተል (NGS) እስኪፈጠር ድረስ ከ30 ዓመታት በላይ በሰፊው ጥቅም ላይ ውሏል። የሳንገር ቅደም ተከተል ቴክኒክ ትክክለኛውን የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ለማወቅ ወይም የአንድ የተወሰነ የዲ ኤን ኤ ቁራጭ መያያዝን አስችሏል። እሱ የተመሰረተው በዲኤንቲፒ (ዲኤንቲፒ) መራጭ ውህደት እና የዲኤንኤ ውህደት መቋረጥ በብልት ዲኤንኤ መባዛት ወቅት ነው። በአጎራባች ኑክሊዮታይድ መካከል የphosphodiester ቦንድ ምስረታ ለመቀጠል የ3' OH ቡድኖች አለመኖር የዲዲኤንቲፒዎች ልዩ ባህሪ ነው። ስለዚህ፣ አንዴ ዲኤንቲፒ ከተያያዘ፣ የሰንሰለት ማራዘሚያ ይቆማል እና ከዚያ ነጥብ ይቋረጣል። በ Sanger ቅደም ተከተል ውስጥ አራት ddNTP - ddATP፣ ddCTP፣ ddGTP እና ddTTP - ጥቅም ላይ ይውላል። እነዚህ ኑክሊዮታይዶች በማደግ ላይ ባለው የዲ ኤን ኤ ውስጥ ሲካተቱ የዲኤንኤ መባዛት ሂደትን ያቆማሉ እና አጭር የዲ ኤን ኤ ርዝማኔን ያስከትላሉ።Capillary gel electrophoresis በስእል 01 ላይ እንደሚታየው እነዚህን አጫጭር የዲኤንኤ ክሮች በመጠን በጄል ለማደራጀት ይጠቅማል።
ምስል 1፡ Capillary gel electrophoresis የተቀናጀ አጭር ዲኤንኤ
ዲኤንኤ ውስጥ በብልቃጥ ለመድገም ጥቂት መስፈርቶች መቅረብ አለባቸው። እነሱም የዲኤንኤ ፖሊመሬሴ ኢንዛይም፣ አብነት ዲኤንኤ፣ ኦሊጎኑክሊዮታይድ ፕሪመርሮች እና ዲኦክሲኑክሊዮታይድ (ዲኤንቲፒ) ናቸው። በሳንገር ቅደም ተከተል፣ የዲኤንኤ መባዛት በአራት የተለያዩ የሙከራ ቱቦዎች ከአራት ዓይነት ddNTP ጋር በተናጠል ይከናወናል። Deoxynucleotides ሙሉ በሙሉ በሚመለከታቸው ddNTPs አይተኩም። የዲኤንቲፒ (ለምሳሌ dATP + ddATP) ድብልቅ በቱቦው ውስጥ ተካትቶ ይባዛል። በአራት የተለያዩ ጉድጓዶች ውስጥ አራት የተለያዩ የቧንቧ ምርቶች በጄል ላይ ይሠራሉ. ከዚያም ጄል በማንበብ, በስእል 02 እንደሚታየው ቅደም ተከተል መገንባት ይቻላል.
ሥዕል 02፡ Sanger ቅደም ተከተል
Sanger ተከታታይነት በብዙ የሞለኪውላር ባዮሎጂ ዘርፎች የሚረዳ ጠቃሚ ዘዴ ነው። የሰው ልጅ ጂኖም ፕሮጀክት በሳንገር ቅደም ተከተል ላይ በተመሰረቱ ዘዴዎች በመታገዝ በተሳካ ሁኔታ ተጠናቀቀ። የሳንገር ቅደም ተከተል በዲኤንኤ ቅደም ተከተል ፣ በካንሰር እና በዘረመል በሽታ ምርምር ፣ በጂን አገላለጽ ትንተና ፣ በሰዎች መለያ ፣ በሽታ አምጪ ህዋሳትን መለየት ፣ በማይክሮባዮል ቅደም ተከተል ወዘተ ጠቃሚ ነው ።
የSanger ቅደም ተከተል በርካታ ጉዳቶች አሉ፡
- የዲኤንኤው ተከታታይነት ያለው ርዝመት ከ1000 የመሠረት ጥንዶች ሊሆን አይችልም።
- በአንድ ጊዜ አንድ ፈትል ብቻ ነው የሚደረደረው።
- ሂደቱ ጊዜ የሚወስድ እና ውድ ነው።
በመሆኑም እነዚህን ችግሮች ለማሸነፍ አዳዲስ የላቁ የቅደም ተከተል ቴክኒኮች በጊዜ ተዘጋጅተዋል። ነገር ግን የሳንገር ቅደም ተከተል እስከ 850 የሚጠጉ የመሠረታዊ ጥንድ ርዝመት ቁርጥራጮች በከፍተኛ ትክክለኛ ውጤቶቹ ምክንያት አሁንም ጥቅም ላይ ውሏል።
Pyrosequencing ምንድን ነው?
Pyrosequencing በ"ቅደም ተከተል" ላይ የተመሰረተ ልቦለድ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴ ነው። ይህ ዘዴ በኑክሊዮታይድ ውህደት ላይ የፒሮፎስፌት ልቀት በማግኘት ላይ የተመሰረተ ነው. ሂደቱ በአራት የተለያዩ ኢንዛይሞች ማለትም ዲ ኤን ኤ ፖሊመርዝ፣ ኤቲፒ ሰልፈሪላሴ፣ ሉሲፈራሴ እና አፒራሴ እና ሁለት አዴኖሲን 5’ ፎስፎሰልፌት (ኤፒኤስ) እና ሉሲፈሪን ያሉ ሁለት ንኡስ ንጥረ ነገሮች ተቀጥረዋል።
ሂደቱ የሚጀምረው በነጠላ ገመድ ካለው የዲ ኤን ኤ አብነት ጋር በማያያዝ በፕሪመር ሲሆን እና ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ የኑክሊዮታይድ ማሟያዎችን ማካተት ይጀምራል። ኑክሊዮታይዶች አንድ ላይ ሲቀላቀሉ (ኒውክሊክ አሲድ ፖሊሜራይዜሽን) ፒሮፎስፌት (ሁለት ፎስፌት ቡድኖች አንድ ላይ የተሳሰሩ) ቡድኖችን እና ሃይልን ያስወጣል።እያንዳንዱ ኑክሊዮታይድ መጨመር እኩል የሆነ የፒሮፎስፌት መጠን ይለቃል። ፒሮፎስፌት በ ATP ሰልፈርላይዝ ወደ ኤቲፒ ይቀየራል substrate APS ሲኖር። የተፈጠረው ኤቲፒ የሉሲፈራዝ መካከለኛ የሉሲፈሪንን ወደ ኦክሲሉሲፈሪን በመቀየር ከኤቲፒዎች መጠን ጋር ተመጣጣኝ በሆነ መጠን የሚታይ ብርሃን ይፈጥራል። ብርሃን በፎቶን ማወቂያ መሳሪያ ወይም በፎቶmultiplier ተገኝቶ ፒሮግራም ይፈጥራል። አፒራይዝ በአፀፋው ድብልቅ ውስጥ ATP እና ያልተካተቱ ዲኤንቲፒዎችን ያዋርዳል። dNTP መጨመር በአንድ ጊዜ ይከናወናል. የኑክሊዮታይድ መጨመር በብርሃን ውህደት እና በማወቅ መሰረት ስለሚታወቅ የአብነት ቅደም ተከተል ሊታወቅ ይችላል. ፒሮግራም በስእል 03 እንደሚታየው የናሙናውን ዲ ኤን ኤ ኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ለማምረት ያገለግላል።
Pyrosequencing በነጠላ ኑክሊዮታይድ ፖሊሞርፊዝም ትንተና እና የዲኤንኤ አጭር ዝርጋታ ቅደም ተከተል በጣም አስፈላጊ ነው። ከፍተኛ ትክክለኝነት፣ተለዋዋጭነት፣የአውቶሜሽን ቀላልነት እና ትይዩ ሂደት የፒሮሴክዌንሲንግ ከሳንገር ተከታታይ ቴክኒኮች ጥቅሞች ናቸው።
ሥዕል 03፡ ፒሮሴክዌንሲንግ
በSanger Sequencing እና Pyrosequencing መካከል ያለው ልዩነት ምንድን ነው?
Sanger ቅደም ተከተል vs Pyrosequencing |
|
| Sanger ቅደም ተከተል ዲኤንቲፒዎችን በዲኤንኤ ፖሊሜሬዝ በማዋሃድ እና በሰንሰለት መቋረጥ ላይ የተመሰረተ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴ ነው። | Pyrosequencing ኑክሊዮታይድ ሲዋሃድ የፒሮፎስፌት ልቀት በማግኘት ላይ የተመሰረተ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ዘዴ ነው። |
| የddNTP አጠቃቀም | |
| ddNTPs የዲኤንኤ መባዛትንለማቋረጥ ይጠቅማሉ። | ddNTPs ጥቅም ላይ አይውሉም። |
| የተካተቱ ኢንዛይሞች | |
| DNA polymerase ጥቅም ላይ ይውላሉ። | አራት ኢንዛይሞች ጥቅም ላይ ይውላሉ፡DNA polymerase፣ ATP sulfurylase፣ Luciferase እና Apyrase። |
| ንዑስ ጥቅሶች | |
| APS እና Luciferin ጥቅም ላይ አይውሉም። | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) እና luciferin ጥቅም ላይ ይውላሉ። |
| ከፍተኛው የሙቀት መጠን | |
| ይህ ቀርፋፋ ሂደት ነው። | ይህ ፈጣን ሂደት ነው። |
ማጠቃለያ – የሳንገር ቅደም ተከተል vs ፒሮሴክዌንሲንግ
Sanger sequencing እና Pyrosequencing በሞለኪውላር ባዮሎጂ ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውሉ ሁለት የDNA ተከታታይ ዘዴዎች ናቸው። የሳንገር ቅደም ተከተል የሰንሰለቱን ማራዘሚያ በማቆም በቅደም ተከተል የኑክሊዮታይዶችን ቅደም ተከተል ይገነባል ፣ ፓይሮሴክዊንግ ደግሞ ኑክሊዮታይድን በቅደም ተከተል በማዋሃድ እና የፒሮፎስፌትስ መውጣቱን በመለየት ትክክለኛውን የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ይገነባል።ስለዚህ በሳንገር ቅደም ተከተል እና በፒሮሴክዊንሲንግ መካከል ያለው ዋና ልዩነት የሳንገር ቅደም ተከተል በሰንሰለት መቋረጥ ላይ ሲሰራ ፒሮሴክዊንግ ደግሞ በሲንተሲስ ላይ ይሰራል።
